2019年新冠肺炎病毒出現在中國武漢後, 不斷有美歐國家千方百計把所有一切負面東西傾倒在中國，就連救治的中醫藥都不放過，一味黑、造謠、誣蔑!
2019～今天，中醫藥在中國治疫的臨床上，事事實實作了極大貢獻。
今天，老安把防治新冠肺炎的中成藥的科學研究及臨床報告轉貼於此，讓人們知道，中醫藥不是吹的!!!
轉貼如下:
連花清瘟膠囊提高COVID-19臨床治愈率的機製：
基於網絡藥理學和分子對接技術
Abstract
節錄
目的
基於網絡藥理學和分子對接技術探討連花清瘟膠囊提高COVID-19臨床治愈率的作用靶點、信號通路和生物學功能。
方法
利用TCMSP、SwissTarget Prediction、CooLGeN、GeneCards、DAVID等數據庫，以連花清瘟膠囊中的連翹、金銀花、炙麻黃等13味藥來檢索活性成分及其靶點蛋白，篩選與COVID-19及其臨床表現(發熱、咳嗽、乏力)共有的靶點蛋白及其信號通路與生物學功能，采用Gephi軟件構建連花清瘟膠囊藥味-活性成分-作用靶點-生物學功能網絡圖。
結果
連花清瘟膠囊中的連翹、金銀花、炙麻黃等13味藥中的MOL000522、MOL003283、MOL003365、MOL003006、MOL003014等160個活性成分通過MAPK1、IL6、HSP90AA1、TNF、CCL2等57個靶點蛋白、NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway等35條信號通路發揮治療COVID-19或干預COVID-19病變過程的作用，影響COVID-19的臨床表現。
分子對接
結果
表明，MOL000522(來自連翹)、MOL001495(來自金銀花)、MOL001494(來自金銀花、炙麻黃)等83個化學成分與MAPK1、IL6、HSP90AA1等12個靶點蛋白的Total Score分值≥5.0，可形成穩定構象，具有較好結合活性。其中，Total Score值≥9.0的有：MOL000522(來自連翹)-MAPK1、MOL004989(來自甘草)-MAPK1、MOL003330(來自連翹)-MAPK1、MOL001495(來自金銀花)-NLRP3、MOL001494(來自金銀花、炙麻黃)-NLRP3、MOL004908(來自甘草、苦杏仁)-HSP90AA1、MOL004863(來自甘草)-HSP90AA1、MOL001749(來自板藍根)-TLR9、MOL004806(來自甘草)-HSP90AA1、MOL001495(來自金銀花)-AKT1。結論連花清瘟膠囊以多藥味、多靶點、多信號通道和多生物學功能發揮提高COVID-19臨床治愈率作用。
Keywords: 網絡藥理學, 分子對接, 連花清瘟膠囊, COVID-19, 臨床治愈率。
中華人民共和國國家衛生健康委辦公廳和中華人民共和國國家中醫藥管理局辦公室發布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案》(試行第七版)(國衛辦醫函〔2020〕184號)[1]明確新型冠狀肺炎(COVID-19)臨床主要表現為發熱、乾咳和乏力。在中醫治療中，明確COVID-19屬於中醫“疫”病範疇，病因為感受“疫戾”之氣，各地可根據病情、當地氣候特點以及不同體質情況進行辯證論治，並推薦連花清瘟膠囊用於醫學觀察期的治療。
Hu等[2]的最新研究論文闡述了連花清瘟膠囊用於臨床治療COVID-19的療效，即經過連花清瘟治療組治療14 d(4粒/次，3次/d)後，連花清瘟膠囊治療組的恢複率達91.5%，明顯高於對照組(82.4%)，且連花清瘟膠囊治療組對於發熱、乏力、咳嗽等症狀的治愈時間中位數明顯縮短。該文認為，從安全性和有效性角度來看，可以考慮使用連花清瘟膠囊改善COVID-19的臨床症狀(發熱、乾咳和乏力)。
以係統生物學理論為基礎的網絡藥理學，通過對生物係統的網絡分析來選取特定信號節點，構建活性成分-蛋白靶點-信號通路之間的複雜網絡來探討藥物的作用機製。現有網絡藥理學研究多關注藥物作用於靶點蛋白用於疾病的治療[3-4]，對於疾病與其臨床症狀共有靶點蛋白間的網絡藥理學研究少有報道。COVID-19的臨床主要表現為發熱、乾咳和乏力。涉及發熱、乾咳和乏力等臨床症狀的靶點蛋白較多，就COVID-19而言，這些臨床症狀似應與COVID-19間存在共有的靶點蛋白。連花清瘟膠囊改善COVID-19的臨床症狀提高臨床治愈率似應是作用於COVID-19及其臨床症狀(發熱、幹咳和乏力)共有靶點蛋白的結果。為此，為更全面地研究連花清瘟膠囊提高COVID-19臨床治愈率的機製和物質基礎，本文以“fever ”“、coughing ”“、fatigue ”等臨床表現及“2019-nCoV”、“COVID-19”為疾病關鍵詞，篩選出“fever ”、“coughing ”、“fatigue ”、“2019-nCoV”、“COVID-19”中的共同靶點蛋白。同時選取連花清瘟膠囊中連翹、金銀花等13味中藥，對涉及到的活性成分進行篩選，通過網絡藥理學方法研究連花清瘟膠囊提高COVID-19臨床治愈率的潛在作用靶點和信號通路及生物學過程，並采用分子對接技術研究核心活性成分與主要通路中的靶點蛋白的對接，探討連花清瘟膠囊提高COVID-19臨床治愈率的機製和物質基礎。
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1. 資料和方法
1.1. 數據資料來源
1.1.1. 藥材來源
連花清瘟膠囊(國藥準字Z20040063)由石家莊以嶺藥業股份有限公司生產。成分為：連翹、金銀花、炙麻黃、炒苦杏仁、石膏、板藍根、綿馬貫眾、魚腥草、廣藿香、大黃、紅景天、薄荷腦、甘草。功能主治為清瘟解毒、宣肺泄熱。用於治療流行性感冒屬熱毒襲肺證，症見：發熱或高熱，惡寒，肌肉酸痛，鼻塞流涕，咳嗽，頭痛，咽乾咽痛，舌偏紅，苔黃或黃膩等。
1.1.2. 活性成分來源
通過中藥係統藥理學數據庫與分析平台(TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，https://tcmspw.com/tcmsp.php)及有關文獻[5]，分別以連花清瘟膠囊中的13味藥來檢索活性成分，其中炙麻黃、炒苦杏仁、綿馬貫眾分別按麻黃、苦杏仁、貫眾進行檢索。選擇符合口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥ 30%、類藥性(drug like, DL)≥0.18並合並各藥味中相同的活性成分，繪製結構式並以MDL SDfile(*.sdf)格式保存(檢索日期：2020年10月28日)。將這些活性成分的MDL SDfile(*.sdf)格式結構式導入SwissTargetPrediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)，檢索符合Probability≥0.1的活性成分靶點蛋白(檢索日期：2020年11月2日)。
1.1.3. 候選靶標來源
利用CooLGeN (http://ci.smu.edu.cn/CooLGeN/Home.php)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、TTD (http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)數據庫，以“fever ”、“coughing ”、“fatigue ”、“2019-nCoV”、“COVID-19”為關鍵詞，收集臨床表現及疾病靶點蛋白(選擇標示符為All human genes)，篩選臨床表現與疾病共有靶點蛋白，再進一步選擇與藥材中活性成分相匹配的靶點蛋白。
1.2. 靶點通路及生物學功能注釋分析
將靶點蛋白複製至DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)的列表中，選擇標示符為official_ gene_symbol，物種注釋為Homo sapiens，進行靶點蛋白的GOTERM_BP_DIRECT、GOTERM_CC_DIRECT、GOTERM_MF_DIRECT富集分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)_PATHWAY通路注釋分析。
1.3. 活性成分-蛋白靶點-生物學功能網絡分析和構建
根據預測結果，使用Gephi0.9.2軟件將篩選出來的活性成分、蛋白靶點和生物學功能構建活性成分-蛋白靶點-生物學功能網絡。
1.4. 分子對接分析
本文以SYBYL-X 2.1.1對接軟件對靶點蛋白和化學成分進行分子對接分析，獲得Total Score值。
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2. 結果
2.1. 連花清瘟膠囊各藥味中活性成分
通過TCMSP及有關文獻[5]共檢索到連花清瘟膠囊各藥味中符合OB≥30%、DL≥0.18的活性成分(合並各藥味中相同的活性成分)210個。
2.2. 靶點的預測
將“2.1”中符合OB≥30%、DL≥0.18的活性成分以MDL SDfile(*.sdf)格式導入SwissTargetPrediction數據庫，獲得蛋白靶點信息24215條，涉及1320個化學靶點蛋白。篩選符合Probability≥0.1的活性成分靶點蛋白，獲得蛋白靶點信息12 274條，涉及1159個化學靶點蛋白。
利用CooLGeN、GeneCards、TTD數據庫，以“2019-nCoV”、“COVID-19”為關鍵詞，共收集疾病靶點蛋白(All human genes)261個(檢索日期：2020年10月28日)。以“fever ”、“coughing ”、“fatigue ”為關鍵詞，分別收集疾病臨床表現靶點蛋白7237、4157、7127個。“fever ”“、coughing ”“、fatigue ”與COVID-19的共有靶點蛋白分別為154、176、106個。篩選各藥材中與“fever ”“、coughing ”“、fatigue ”與COVID-19的共有靶點蛋白相同的靶點蛋白及對應的化學成分。並進一步確定藥材、臨床表現及COVID-19中共同的靶點蛋白共計57個(圖 1)。
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活性成分與COVID-19及其臨床表現(發熱、咳嗽、乏力)的靶點蛋白
Target proteins of active ingredients in Lianhua Qingwen capsule, COVID-19 and its clinical manifestations (fever, cough, and fatigue).
活性成分與COVID-19及其臨床表現(發熱、咳嗽、乏力)的共有靶點蛋白共計57個：ABL1、ACE、ACE2、AGTR1、AKT1、ALK、AR、BTK、CALCA、CASP1、CASP3、CCL2、CCR5、CTSL、CXCL8、DHODH、DPP4、EGFR、FLT3、G6PD、HPSE、HSP90AA1、HSPA5、IDH1、IL2、IL6、JAK1、JAK2、LNPEP、MAPK1、MCL1、MGMT、MPO、MTOR、NFKB1、NLRP3、NR3C1、P2RX7、PARP1、PIK3CG、PLAT、PLAUR、PLG、PPARA、REN、ROS1、TK1、TLR4、TLR7、TLR9、TNF、TRPV1、TRPV4、TTR、VCP、VEGFA、XPO1，涉及11味藥、160個活性成分(注：本文活性成分均以Mol ID表示，具體成分名稱可檢索TCMSP數據庫)。藥材、化學成分及靶點蛋白信息(以MAPK1、NLRP3、HSP90AA1、TLR9、AKT為代表)：
AKT1靶點蛋白：MOL000006(金銀花、連翹、炙麻黃)，MOL000098(甘草、廣藿香、金銀花、連翹、魚腥草、炙麻黃)，MOL000239、MOL000354、MOL004828、MOL004863、MOL004866、MOL004891、MOL004904、MOL004949、MOL004961(甘草)，MOL000422(甘草、金銀花、連翹、綿馬貫眾、魚腥草、炙麻黃)，MOL001495、MOL003044、MOL003117(金銀花)，MOL001735(板藍根)，MOL002235(大黃)，MOL002823、MOL002881、MOL005842(炙麻黃);
HSP90AA1靶點蛋白：MOL000500、MOL004806、MOL004838、MOL004849、MOL004855、MOL004856、MOL004857、MOL004863、MOL004864、MOL004883、MOL004884、MOL004904、MOL004905、MOL004910、MOL004911、MOL004935、MOL004945、MOL004949、MOL004959、MOL004980、MOL004988、MOL004989、MOL005001、MOL005008、(甘草)，MOL001040(綿馬貫眾)，MOL002311、MOL004908(甘草、苦杏仁)，MOL003283、MOL003370(連翹)，MOL005016(甘草、廣藿香);
MAPK1靶點蛋白：MOL000522、MOL003283、MOL003330、MOL003370(連翹)，MOL001728、MOL001774、MOL001803(板藍根)，MOL004806、MOL004808、MOL004838、MOL004891、MOL004905、MOL004959、MOL004988、MOL004989 (甘草)，MOL004908(甘草、苦杏仁)，MOL005911(廣藿香);
NLRP3靶點蛋白：MOL001495(金銀花)，MOL001494(金銀花、炙麻黃);
TLR9靶點蛋白：MOL000392、MOL000417、MOL002844、MOL004815、MOL004833、MOL004879、MOL004885、MOL004891、MOL004907、MOL004957、MOL004990、MOL005016 (甘草)，MOL001728、MOL001749(板藍根)，MOL004908(甘草、苦杏仁)。
2.3. 靶點信號通路與Gene Ontology(GO)分析
將連花清瘟膠囊中各藥味活性成分與COVID-19及其臨床表現(發熱、咳嗽、乏力)共有的57個靶點蛋白導入DAVID數據庫，進行靶點蛋白的GOTERM_BP_DIRECT、GOTERM_CC_DIRECT、GOTERM_MF_DIRECT富集分析和KEGG_PATHWAY通路注釋分析。信號通路主要涉及NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、Renin-angiotensin system等35條信號通路。其中Benjamini correction < 0.01的信號通路共有10條(圖 2)。
2
連花清瘟膠囊中活性成分潛在靶點的KEGG信號通路富集分析
Enrichment analysis of KEGG signal pathway of potential targets of the active components in Lianhua Qingwen capsule. 6park.com
連花清瘟膠囊中的160個活性成分通過MAPK1，IL6，HSP90AA1，TNF，CCL2，NFKB1，CASP1，NLRP3等靶點蛋白參與COVID-19及其臨床表現(發熱、咳嗽、乏力)的生物過程、細胞組成和分子功能。生物過程主要與regulation of apoptosis、regulation of programmed cell death等有關，細胞組成主要與cell surface、extracellular space等有關，分子功能主要與protein tyrosine kinase activity、ATP binding等有關(圖 3、4)。
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連花清瘟膠囊中活性成分潛在靶點與COVID-19及其臨床表現(發熱、咳嗽、乏力)相關的GOTERM_BP_FAT富集分析
GOTERM_BP_FAT enrichment analysis of the potential targets of active components in Lianhua Qingwen capsule and the biological functions related to COVID-19 and its clinical manifestations (fever, cough, and fatigue) (Benjamini correction ≤0.0001).
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連花清瘟膠囊中活性成分潛在靶點與COVID-19及其臨床表現(發熱、咳嗽、乏力)相關的富集分析
GOTERM_CC_FAT (A) and GOTERM_MF_FAT (B) enrichment analysis of the potential target of active components in Lianhua Qingwen capsule and the biological function related to COVID-19 and its clinical manifestations (fever, cough, fatigue) (Benjamini correction ≤0.01).
2.4. 活性成分-靶點蛋白-信號通路網絡的構建
使用Gephi 0.9.2軟件構建化學成分-靶點蛋白-信號通路網絡。連花清瘟膠囊中的160個活性成分通過57個靶點蛋白、35條信號通路發揮治療COVID-19或幹預COVID-19病變過程的作用，網絡關係複雜、蛋白靶點與信號通路多(圖 5)。
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連花清瘟膠囊中藥味-部分活性成分-靶點蛋白-作用通路網絡圖
Network diagram of medicinal ingredients (
)-active component (
)-target protein (
) -action pathway (
) in Lianhua Qingwen capsule.
2.5. 部分活性成分與靶點蛋白分子對接結果分析
鑒於NOD-like receptor signaling pathway、Tolllike receptor signaling pathway的Benjamini correction較小，為5.8E-5、1.5E-6。為此，以NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway涉及的靶點蛋白MAPK1(PDB ID:6SLG)、IL6(PDB ID:1ALU)、HSP90AA1(PDB ID:3O0I)、TNF(PDB ID: 6M95)、CCL2(PDB ID:5J5Y)、NFKB1(PDB ID: 1LE9)、CASP1(PDB ID:1RWV)、NLRP3(PDB ID: 3VWE)、PIK3CG(PDB ID: 2A4Z)、AKT1(PDB ID: 4GAH)、TLR4(PDB ID:3FXI)、TLR7(PDB ID:5T1S)、TLR9(PDB ID:5WYX)為例，對靶點蛋白和化學成分進行分子對接結果分析，驗證連花清瘟膠囊化學成分與靶點蛋白的作用。配體與受體間低能量的穩定構象預示著二者間有較大的作用可能性。一般以結合能≤−5 kJ/mol或Total Score值≥5.0作為篩選標準。本文以SYBYL-X 2.1.1對接軟件進行分子對接，獲得Total Score值(表 1)。分子對接結果表明，MOL000522、MOL001495、MOL001494等83個化學成分與MAPK1、IL6、HSP90AA1等12個靶點蛋白的Total Score值≥5.0。Total Score值≥9.0的代表性核心活性成分與靶點蛋白分子對接模式(圖 6)。
1
NOD-like and Toll-like receptor signaling pathway各化學成分與靶點蛋白作用的Total Score值
Total score values of each chemical component interacting with target protein in NOD like and total like receptor signaling pathway
No.Medicinal materialsChemical compositionTarget proteinTotal ScoreMOL0017284.9750Isatidis radixMOL0017744.7116MOL0018038.7373MOL0048068.2133MOL0048086.5849MOL0048385.7862Glycyrrhizae radix et rhizomaMOL0048916.0748MOL0049054.27351MOL004959MAPK17.1327MOL0049885.8852MOL0049899.2094Glycyrrhizae radix et rhizoma、Armeniacae semen amarumMOL0049086.7727Pogostemonis herbaMOL0059115.7615MOL00052210.231Forsythiae fructusMOL0032835.6543MOL0033309.0596MOL0033705.8832Isatidis radixMOL0017742.77122Armeniacae semen amarumMOL002211IL67.2272Forsythiae fructusMOL0033655.8637MOL0005007.0339MOL0048069.0092MOL0048385.4535MOL0048498.8892MOL0048558.9802MOL0048566.7809MOL0048577.8582MOL0048639.4006MOL0048648.6671MOL0048838.3102MOL0048847.3729MOL0049045.8715Glycyrrhizae radix et rhizomaMOL0049051.7412MOL0049107.6057MOL0049117.15483MOL004935HSP90AA18.6197MOL0049457.7389MOL0049497.6895MOL0049597.5331MOL0049807.0161MOL0049886.5771MOL0049897.9668MOL0050018.1583MOL0050167.0515MOL0050085.7821Glycyrrhizae radix et rhizoma、Armeniacae semen amarumMOL0049089.5050MOL0023116.2047Pogostemonis herbaMOL0059166.7172Forsythiae fructusMOL0032836.3775MOL0033706.1435Ryopteridis crassirhizomatis rhizomaMOL0010406.2675Isatidis radixMOL0017908.6973MOL0048487.6923MOL004905-13.04914Glycyrrhizae radix et rhizomaMOL004935TNF8.3922MOL0049595.2719MOL0049898.7198MOL005013-12.0236Forsythiae fructusMOL0033655.59135Forsythiae fructusMOL000791CCL26.54406Glycyrrhizae radix et rhizoma 、Armeniacae semen amarumMOL002311NFKB13.3351Glycyrrhizae radix et rhizomaMOL0050003.8014MOL0028445.1758Glycyrrhizae radix et rhizomaMOL0050132.56807Lonicerae japonicae flosMOL003006 MOL003014CASP15.2431 5.6239Forsythiae fructusMOL0033303.3774Lonicerae japonicae flos、EphedraeMOL001494NLRP39.86838herba praeparata cum melleLonicerae japonicae flosMOL00149510.1359MOL0018036.2639Isatidis radixMOL0018146.6419Rhei radix et rhizomeMOL0022357.3826Glycyrrhizae radix et rhizoma、Pogostemonis herba、japonicae flos、Forsythiae fructus、Houttuyniae herba、Ephedrae herbaMOL0000986.0542praeparata cum melleMOL0002396.1381MOL0003547.2169MOL0005005.8799MOL0025653.9326MOL0028444.9174MOL0048106.4536MOL0048668.1841Glycyrrhizae radix et rhizomaMOL0048913.8563MOL0049047.64799MOL004905PIK3CG-4.5592MOL0049414.8181MOL0049616.2743MOL0049665.1168MOL0049746.9209MOL0049898.4427MOL0050076.3041Pogostemonis herbaMOL0059117.0538Lonicerae japonicae flosMOL0030957.6467Armeniacae semen amarumMOL0129226.5879MOL0001735.3401MOL0032907.2718Forsythiae fructusMOL0033087.3495MOL0033307.7492Ryopteridis crassirhizomatis rhizomaMOL0026050.8139MOL0028236.0577Ephedrae herba praeparata cum melleMOL0058425.6310Isatidis radixMOL0017355.9142Rhei radix et rhizomeMOL0022356.8423Glycyrrhizae radix et rhizoma、Pogostemonis herba、 japonicae flos、Forsythiae fructus、Houttuyniae herba、Ephedrae herbaMOL0000985.822310praeparata cum melleMOL000422AKT15.4487Glycyrrhizae radix et rhizoma、Lonicerae japonicae flos、Forsythiae fructus、ryopteridis crassirhizomatis rhizoma、Houttuyniae herba、Ephedrae herba praeparata cum melleMOL0002395.8410MOL0003546.6103MOL0048285.9371MOL0048638.0458Glycyrrhizae radix et rhizomaMOL0048667.7877MOL0048914.2970MOL0049044.6532MOL0049497.8296MOL0049616.2984Lonicerae japonicae flos、Forsythiae fructus、Ephedrae herba praeparata
cum melleMOL000006AKT16.0612MOL0014959.7707Lonicerae japonicae flosMOL0030446.1451MOL0031175.1368MOL0028235.2484Ephedrae herba praeparata cum melleMOL0028817.1609MOL0058426.395711Ryopteridis crassirhizomatis rhizomaMOL002605TLR44.885112Glycyrrhizae radix et rhizomaMOL004988TLR77.2271Isatidis radixMOL0017286.1353MOL00174910.2153Glycyrrhizae radix et rhizoma、Armeniacae semen amarumMOL0049084.3256MOL0003926.7941MOL0004177.4214MOL0028446.8041MOL0048158.943813MOL004833TLR95.7856Glycyrrhizae radix et rhizomaMOL0048798.0629MOL0048855.5260MOL0048915.4322MOL0049076.7363MOL0049578.3794MOL0049908.3002MOL0050167.7733
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代表性核心活性成分與靶點蛋白分子對接模式
Molecular docking mode of representative core active components and target proteins (Total Score ≥9.0).
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3. 討論
通過網絡藥理學研究連花清瘟膠囊與COVID-19的臨床表現(“fever ”“、coughing ”“、fatigue ”)關係結果可知，在涉及到的35條信號通路中，Benjamini correction最小的2個信號通路為NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway，Benjamini correction分別為5.8E-5、1.5E-6。NOD受體可識別進入細胞內的病原微生物及其產物，快速啟動信號傳遞，激活天然免疫效應機製; Toll受體可識別細胞外病原體，並將信號傳遞至細胞內激發機體天然免疫係統。二種模式識別受體可獨立進行自我辨識，同時又相互聯係協調，在啟動天然免疫反應中共同發揮重要作用，可激活免疫係統，破壞免疫耐受狀態，糾正自身免疫性疾病[6-7]。連花清瘟膠囊提高COVID-19的臨床治愈率可能主要與提高患者自身免疫能力、抑製炎症反應有關。為此，以NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway涉及的靶點蛋白及其化學成分進行了分子對接結果分析，驗證連花清瘟膠囊化學成分與靶點蛋白的作用。MOL000522、MOL001495、MOL001494等83個化學成分與MAPK1、IL6、HSP90AA1等12個靶點蛋白的Total Score值≥5.0，Total Score值≥9.0涉及到的主要靶點蛋白有MAPK1、NLRP3、HSP90AA1、TLR9、AKT1。
MAPK可調節細胞增殖、分化、死亡、應激反應和凋亡等關鍵細胞活動[8]，在細胞生命中起著重要作用[9]。MAPK1是多種生化信號的整合點，參與細胞增殖分化、轉錄調控和細胞的有絲分裂自噬等多種生物學過程，在治療各種炎症性疾病中發揮重要作用，也是急性肺損傷(ALI)炎症反應和LPS誘導的細胞損傷的重要調節因子[10-14]。由本文網絡藥理學和分子對接結果可知，來自連翹、甘草、板藍根、苦杏仁、廣藿香的14個化學成分與MAPK1靶點蛋白的分子對接結果Total Score值>5.0，其中MOL000522(連翹)、MOL004989(甘草)、MOL003330(連翹)與MAPK1靶點蛋白的分子對接結果Total Score值>9.0。連花清瘟膠囊作用於MAPK1靶點蛋白，可能通過細胞凋亡調控、細胞程序性死亡的調控等生物學途徑，提高患者自身免疫能力、抑製炎症反應發揮提高COVID-19臨床治愈率作用。
NLRP3炎症小體作為機體固有免疫及應激係統的重要防禦成分，不但可以識別細菌、病毒等病原體引發機體發生固有免疫應答，還負責炎症反應的激活[15-17]，參與了多種疾病發生和進展[18]，在先天免疫中起著重要作用[19]。近年來，愈來愈多的研究表明NLRP3炎性體在肺部感染性疾病中參與並發揮多種作用[20]。如在各種類型ALI中介導了炎症介質的生成和炎症細胞的浸潤，增加肺泡上皮細胞的通透性，促進肺水腫的形成[21]。抑製或缺失NLRP3可特異性減輕輻射和脂多糖治療引起的小鼠肺部炎症[22]。中藥成分也可通過抑製NLRP3炎症小體活化，繼而減輕脂多糖誘導的ALI[23-25]。由本文網絡藥理學和分子對接結果可知，MOL001494(金銀花、炙麻黃)、MOL001495(金銀花)與NLRP3靶點蛋白的分子對接結果Total Score值>9.0。連花清瘟膠囊作用於NLRP3靶點蛋白，可能通過細胞凋亡調控、細胞程序性死亡的調控等生物學途徑，提高機體固有免疫及應激功能，激活並參與炎症反應，在提高COVID-19臨床治愈率中發揮重要作用。
作為鳥流感病毒結合受體的細胞表麵蛋白HSP90AA1在感染早期通過HSP90AA1-AKT-MTOR途徑誘導自噬。一旦病毒識別，HSP90AA1和AKTMTOR通路的直接連接會觸發自噬，這是控製感染的關鍵步驟[26]。由本文網絡藥理學和分子對接結果可知，來自連翹、甘草、苦杏仁、廣藿香、綿馬貫眾的30個化學成分與HSP90AA1靶點蛋白的分子對接結果Total Score值>5.0，其中MOL004908(甘草、苦杏仁)、MOL004863、MOL004806(甘草)與HSP90AA1靶點蛋白的分子對接結果Total Score值>9.0。連花清瘟膠囊作用於HSP90AA1靶點蛋白，可能通過對有機物的反應、細胞生物合成過程的正調控等生物學途徑，觸發自噬控製病毒感染，在提高COVID-19臨床治愈率中發揮重要作用。
TLR9可激活固有免疫係統，參與傳染病檢測[27-28]。TLR9和磷脂酰肌醇-3-激酶γ(PI3Kγ)是免疫應答中非常重要的效應因子。免疫應答需要PI3Kγ，其中TLR9是相關的觸發因子[29-30]。在穩態條件下，不適當的TLR9反應可導致嚴重的自體炎症性疾病，阻斷TLR9炎症通路被激活，控製疾病進展和炎症並發症[31]。在肺缺血再灌注過程中釋放的線粒體DNA(mtDNA)會觸發TLR9依賴性網絡的形成，並導致肺損傷[32]。由本文網絡藥理學和分子對接結果可知，來自板藍根、甘草、苦杏仁的14個化學成分與TLR9靶點蛋白的分子對接結果Total Score值>5.0，其中MOL001749(板藍根)與TLR9靶點蛋白的分子對接結果Total Score值>9.0。連花清瘟膠囊作用於TLR9靶點蛋白，可能通過對傷害的反應、細胞因子產生的調節、細胞生物合成過程的正調控等生物學途徑，激活固有免疫係統，在預防疾病進展和炎症並發症的發展中起到作用[31]，提高COVID-19臨床治愈率。
AKT1是調節細胞存活的信號通路中的一個中心節點。AKT1調控的多種途徑在細胞內通過100多種細胞底物的磷酸化進行溝通[33]。如肺纖維化和高碳酸血症。特發性肺纖維化是一種進行性間質性肺炎，以成纖維細胞聚集、膠原沉積和細胞外基質重塑為特征。AKT1通過誘導巨噬細胞產生IL-13來調節肺纖維化，表明靶向AKT1可能同時阻斷特發性肺纖維化的纖維化過程[34]。高碳酸血症是嚴重急性和慢性肺部疾病患者死亡的危險因素。靶向AKT1或升高CO2信號的下遊通路可以增強巨噬細胞抗病毒宿主的防禦能力，並改善晚期肺部疾病高碳酸血症患者的臨床預後[35]。由本文網絡藥理學和分子對接結果可知，來自甘草、金銀花、連翹、綿馬貫眾、魚腥草、炙麻黃、廣藿香、金銀花、板藍根、大黃的18個化學成分與AKT1靶點蛋白的分子對接結果Total Score值>5.0，其中MOL001495(金銀花)與AKT1靶點蛋白的分子對接結果Total Score值>9.0。連花清瘟膠囊作用於AKT1靶點蛋白，可能通過細胞凋亡調控、細胞程序性死亡的調控、細胞死亡調控、多細胞生物過程的正調控等生物學途徑，在提高COVID-19臨床治愈率中發揮重要作用。
COVID-19屬中醫肺絡病，其臨床病理特征是免疫係統功能障礙和炎症反應引起的深氣道、肺泡的損害，還可見重度肺充血。連花清溫膠囊以絡病理論為指導，對許多病毒如sars-CoV、mers-CoV和炎症反應有抑製作用，已納入國家的COVID-19診斷和治療計劃，其理論組方特色和臨床基礎研究已得到廣泛認可，是治療呼吸係統疾病的代表性藥物[36]。最新研究表明[36]，連花清瘟膠囊可抑製體外培養的COVID-19活性，顯著緩解COVID-19患者的發熱、咳嗽、乏力等症狀，為連花清瘟膠囊治療COVID-19提供了理論和臨床依據。
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Biography
鄢海燕，教授，E-mail: moc.621@1080yhy
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Funding Statement
2018年度安徽省省級質量工程項目(2018jyxm1273)
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References
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結果
表明，MOL000522(來自連翹)、MOL001495(來自金銀花)、MOL001494(來自金銀花、炙麻黃)等83個化學成分與MAPK1、IL6、HSP90AA1等12個靶點蛋白的Total Score分值≥5.0，可形成穩定構象，具有較好結合活性。其中，Total Score值≥9.0的有：MOL000522(來自連翹)-MAPK1、MOL004989(來自甘草)-MAPK1、MOL003330(來自連翹)-MAPK1、MOL001495(來自金銀花)-NLRP3、MOL001494(來自金銀花、炙麻黃)-NLRP3、MOL004908(來自甘草、苦杏仁)-HSP90AA1、MOL004863(來自甘草)-HSP90AA1、MOL001749(來自板藍根)-TLR9、MOL004806(來自甘草)-HSP90AA1、MOL001495(來自金銀花)-AKT1。結論連花清瘟膠囊以多藥味、多靶點、多信號通道和多生物學功能發揮提高COVID-19臨床治愈率作用。
Keywords: 網絡藥理學, 分子對接, 連花清瘟膠囊, COVID-19, 臨床治愈率。
中華人民共和國國家衛生健康委辦公廳和中華人民共和國國家中醫藥管理局辦公室發布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案》(試行第七版)(國衛辦醫函〔2020〕184號)[1]明確新型冠狀肺炎(COVID-19)臨床主要表現為發熱、乾咳和乏力。在中醫治療中，明確COVID-19屬於中醫“疫”病範疇，病因為感受“疫戾”之氣，各地可根據病情、當地氣候特點以及不同體質情況進行辯證論治，並推薦連花清瘟膠囊用於醫學觀察期的治療。
Hu等[2]的最新研究論文闡述了連花清瘟膠囊用於臨床治療COVID-19的療效，即經過連花清瘟治療組治療14 d(4粒/次，3次/d)後，連花清瘟膠囊治療組的恢複率達91.5%，明顯高於對照組(82.4%)，且連花清瘟膠囊治療組對於發熱、乏力、咳嗽等症狀的治愈時間中位數明顯縮短。該文認為，從安全性和有效性角度來看，可以考慮使用連花清瘟膠囊改善COVID-19的臨床症狀(發熱、乾咳和乏力)。
以係統生物學理論為基礎的網絡藥理學，通過對生物係統的網絡分析來選取特定信號節點，構建活性成分-蛋白靶點-信號通路之間的複雜網絡來探討藥物的作用機製。現有網絡藥理學研究多關注藥物作用於靶點蛋白用於疾病的治療[3-4]，對於疾病與其臨床症狀共有靶點蛋白間的網絡藥理學研究少有報道。COVID-19的臨床主要表現為發熱、乾咳和乏力。涉及發熱、乾咳和乏力等臨床症狀的靶點蛋白較多，就COVID-19而言，這些臨床症狀似應與COVID-19間存在共有的靶點蛋白。連花清瘟膠囊改善COVID-19的臨床症狀提高臨床治愈率似應是作用於COVID-19及其臨床症狀(發熱、幹咳和乏力)共有靶點蛋白的結果。為此，為更全面地研究連花清瘟膠囊提高COVID-19臨床治愈率的機製和物質基礎，本文以“fever ”“、coughing ”“、fatigue ”等臨床表現及“2019-nCoV”、“COVID-19”為疾病關鍵詞，篩選出“fever ”、“coughing ”、“fatigue ”、“2019-nCoV”、“COVID-19”中的共同靶點蛋白。同時選取連花清瘟膠囊中連翹、金銀花等13味中藥，對涉及到的活性成分進行篩選，通過網絡藥理學方法研究連花清瘟膠囊提高COVID-19臨床治愈率的潛在作用靶點和信號通路及生物學過程，並采用分子對接技術研究核心活性成分與主要通路中的靶點蛋白的對接，探討連花清瘟膠囊提高COVID-19臨床治愈率的機製和物質基礎。
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1. 資料和方法
1.1. 數據資料來源
1.1.1. 藥材來源
連花清瘟膠囊(國藥準字Z20040063)由石家莊以嶺藥業股份有限公司生產。成分為：連翹、金銀花、炙麻黃、炒苦杏仁、石膏、板藍根、綿馬貫眾、魚腥草、廣藿香、大黃、紅景天、薄荷腦、甘草。功能主治為清瘟解毒、宣肺泄熱。用於治療流行性感冒屬熱毒襲肺證，症見：發熱或高熱，惡寒，肌肉酸痛，鼻塞流涕，咳嗽，頭痛，咽乾咽痛，舌偏紅，苔黃或黃膩等。
1.1.2. 活性成分來源
通過中藥係統藥理學數據庫與分析平台(TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，https://tcmspw.com/tcmsp.php)及有關文獻[5]，分別以連花清瘟膠囊中的13味藥來檢索活性成分，其中炙麻黃、炒苦杏仁、綿馬貫眾分別按麻黃、苦杏仁、貫眾進行檢索。選擇符合口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥ 30%、類藥性(drug like, DL)≥0.18並合並各藥味中相同的活性成分，繪製結構式並以MDL SDfile(*.sdf)格式保存(檢索日期：2020年10月28日)。將這些活性成分的MDL SDfile(*.sdf)格式結構式導入SwissTargetPrediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)，檢索符合Probability≥0.1的活性成分靶點蛋白(檢索日期：2020年11月2日)。
1.1.3. 候選靶標來源
利用CooLGeN (http://ci.smu.edu.cn/CooLGeN/Home.php)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、TTD (http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)數據庫，以“fever ”、“coughing ”、“fatigue ”、“2019-nCoV”、“COVID-19”為關鍵詞，收集臨床表現及疾病靶點蛋白(選擇標示符為All human genes)，篩選臨床表現與疾病共有靶點蛋白，再進一步選擇與藥材中活性成分相匹配的靶點蛋白。
1.2. 靶點通路及生物學功能注釋分析
將靶點蛋白複製至DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)的列表中，選擇標示符為official_ gene_symbol，物種注釋為Homo sapiens，進行靶點蛋白的GOTERM_BP_DIRECT、GOTERM_CC_DIRECT、GOTERM_MF_DIRECT富集分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)_PATHWAY通路注釋分析。
1.3. 活性成分-蛋白靶點-生物學功能網絡分析和構建
根據預測結果，使用Gephi0.9.2軟件將篩選出來的活性成分、蛋白靶點和生物學功能構建活性成分-蛋白靶點-生物學功能網絡。
1.4. 分子對接分析
本文以SYBYL-X 2.1.1對接軟件對靶點蛋白和化學成分進行分子對接分析，獲得Total Score值。
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2. 結果
2.1. 連花清瘟膠囊各藥味中活性成分
通過TCMSP及有關文獻[5]共檢索到連花清瘟膠囊各藥味中符合OB≥30%、DL≥0.18的活性成分(合並各藥味中相同的活性成分)210個。
2.2. 靶點的預測
將“2.1”中符合OB≥30%、DL≥0.18的活性成分以MDL SDfile(*.sdf)格式導入SwissTargetPrediction數據庫，獲得蛋白靶點信息24215條，涉及1320個化學靶點蛋白。篩選符合Probability≥0.1的活性成分靶點蛋白，獲得蛋白靶點信息12 274條，涉及1159個化學靶點蛋白。
利用CooLGeN、GeneCards、TTD數據庫，以“2019-nCoV”、“COVID-19”為關鍵詞，共收集疾病靶點蛋白(All human genes)261個(檢索日期：2020年10月28日)。以“fever ”、“coughing ”、“fatigue ”為關鍵詞，分別收集疾病臨床表現靶點蛋白7237、4157、7127個。“fever ”“、coughing ”“、fatigue ”與COVID-19的共有靶點蛋白分別為154、176、106個。篩選各藥材中與“fever ”“、coughing ”“、fatigue ”與COVID-19的共有靶點蛋白相同的靶點蛋白及對應的化學成分。並進一步確定藥材、臨床表現及COVID-19中共同的靶點蛋白共計57個(圖 1)。
1
活性成分與COVID-19及其臨床表現(發熱、咳嗽、乏力)的靶點蛋白
Target proteins of active ingredients in Lianhua Qingwen capsule, COVID-19 and its clinical manifestations (fever, cough, and fatigue).
活性成分與COVID-19及其臨床表現(發熱、咳嗽、乏力)的共有靶點蛋白共計57個：ABL1、ACE、ACE2、AGTR1、AKT1、ALK、AR、BTK、CALCA、CASP1、CASP3、CCL2、CCR5、CTSL、CXCL8、DHODH、DPP4、EGFR、FLT3、G6PD、HPSE、HSP90AA1、HSPA5、IDH1、IL2、IL6、JAK1、JAK2、LNPEP、MAPK1、MCL1、MGMT、MPO、MTOR、NFKB1、NLRP3、NR3C1、P2RX7、PARP1、PIK3CG、PLAT、PLAUR、PLG、PPARA、REN、ROS1、TK1、TLR4、TLR7、TLR9、TNF、TRPV1、TRPV4、TTR、VCP、VEGFA、XPO1，涉及11味藥、160個活性成分(注：本文活性成分均以Mol ID表示，具體成分名稱可檢索TCMSP數據庫)。藥材、化學成分及靶點蛋白信息(以MAPK1、NLRP3、HSP90AA1、TLR9、AKT為代表)：
AKT1靶點蛋白：MOL000006(金銀花、連翹、炙麻黃)，MOL000098(甘草、廣藿香、金銀花、連翹、魚腥草、炙麻黃)，MOL000239、MOL000354、MOL004828、MOL004863、MOL004866、MOL004891、MOL004904、MOL004949、MOL004961(甘草)，MOL000422(甘草、金銀花、連翹、綿馬貫眾、魚腥草、炙麻黃)，MOL001495、MOL003044、MOL003117(金銀花)，MOL001735(板藍根)，MOL002235(大黃)，MOL002823、MOL002881、MOL005842(炙麻黃);
HSP90AA1靶點蛋白：MOL000500、MOL004806、MOL004838、MOL004849、MOL004855、MOL004856、MOL004857、MOL004863、MOL004864、MOL004883、MOL004884、MOL004904、MOL004905、MOL004910、MOL004911、MOL004935、MOL004945、MOL004949、MOL004959、MOL004980、MOL004988、MOL004989、MOL005001、MOL005008、(甘草)，MOL001040(綿馬貫眾)，MOL002311、MOL004908(甘草、苦杏仁)，MOL003283、MOL003370(連翹)，MOL005016(甘草、廣藿香);
MAPK1靶點蛋白：MOL000522、MOL003283、MOL003330、MOL003370(連翹)，MOL001728、MOL001774、MOL001803(板藍根)，MOL004806、MOL004808、MOL004838、MOL004891、MOL004905、MOL004959、MOL004988、MOL004989 (甘草)，MOL004908(甘草、苦杏仁)，MOL005911(廣藿香);
NLRP3靶點蛋白：MOL001495(金銀花)，MOL001494(金銀花、炙麻黃);
TLR9靶點蛋白：MOL000392、MOL000417、MOL002844、MOL004815、MOL004833、MOL004879、MOL004885、MOL004891、MOL004907、MOL004957、MOL004990、MOL005016 (甘草)，MOL001728、MOL001749(板藍根)，MOL004908(甘草、苦杏仁)。
2.3. 靶點信號通路與Gene Ontology(GO)分析
將連花清瘟膠囊中各藥味活性成分與COVID-19及其臨床表現(發熱、咳嗽、乏力)共有的57個靶點蛋白導入DAVID數據庫，進行靶點蛋白的GOTERM_BP_DIRECT、GOTERM_CC_DIRECT、GOTERM_MF_DIRECT富集分析和KEGG_PATHWAY通路注釋分析。信號通路主要涉及NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、Renin-angiotensin system等35條信號通路。其中Benjamini correction < 0.01的信號通路共有10條(圖 2)。
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連花清瘟膠囊中活性成分潛在靶點的KEGG信號通路富集分析
Enrichment analysis of KEGG signal pathway of potential targets of the active components in Lianhua Qingwen capsule. 6park.com
連花清瘟膠囊中的160個活性成分通過MAPK1，IL6，HSP90AA1，TNF，CCL2，NFKB1，CASP1，NLRP3等靶點蛋白參與COVID-19及其臨床表現(發熱、咳嗽、乏力)的生物過程、細胞組成和分子功能。生物過程主要與regulation of apoptosis、regulation of programmed cell death等有關，細胞組成主要與cell surface、extracellular space等有關，分子功能主要與protein tyrosine kinase activity、ATP binding等有關(圖 3、4)。
3
連花清瘟膠囊中活性成分潛在靶點與COVID-19及其臨床表現(發熱、咳嗽、乏力)相關的GOTERM_BP_FAT富集分析
GOTERM_BP_FAT enrichment analysis of the potential targets of active components in Lianhua Qingwen capsule and the biological functions related to COVID-19 and its clinical manifestations (fever, cough, and fatigue) (Benjamini correction ≤0.0001).
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連花清瘟膠囊中活性成分潛在靶點與COVID-19及其臨床表現(發熱、咳嗽、乏力)相關的富集分析
GOTERM_CC_FAT (A) and GOTERM_MF_FAT (B) enrichment analysis of the potential target of active components in Lianhua Qingwen capsule and the biological function related to COVID-19 and its clinical manifestations (fever, cough, fatigue) (Benjamini correction ≤0.01).
2.4. 活性成分-靶點蛋白-信號通路網絡的構建
使用Gephi 0.9.2軟件構建化學成分-靶點蛋白-信號通路網絡。連花清瘟膠囊中的160個活性成分通過57個靶點蛋白、35條信號通路發揮治療COVID-19或幹預COVID-19病變過程的作用，網絡關係複雜、蛋白靶點與信號通路多(圖 5)。
5
連花清瘟膠囊中藥味-部分活性成分-靶點蛋白-作用通路網絡圖
Network diagram of medicinal ingredients (
)-active component (
)-target protein (
) -action pathway (
) in Lianhua Qingwen capsule.
2.5. 部分活性成分與靶點蛋白分子對接結果分析
鑒於NOD-like receptor signaling pathway、Tolllike receptor signaling pathway的Benjamini correction較小，為5.8E-5、1.5E-6。為此，以NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway涉及的靶點蛋白MAPK1(PDB ID:6SLG)、IL6(PDB ID:1ALU)、HSP90AA1(PDB ID:3O0I)、TNF(PDB ID: 6M95)、CCL2(PDB ID:5J5Y)、NFKB1(PDB ID: 1LE9)、CASP1(PDB ID:1RWV)、NLRP3(PDB ID: 3VWE)、PIK3CG(PDB ID: 2A4Z)、AKT1(PDB ID: 4GAH)、TLR4(PDB ID:3FXI)、TLR7(PDB ID:5T1S)、TLR9(PDB ID:5WYX)為例，對靶點蛋白和化學成分進行分子對接結果分析，驗證連花清瘟膠囊化學成分與靶點蛋白的作用。配體與受體間低能量的穩定構象預示著二者間有較大的作用可能性。一般以結合能≤−5 kJ/mol或Total Score值≥5.0作為篩選標準。本文以SYBYL-X 2.1.1對接軟件進行分子對接，獲得Total Score值(表 1)。分子對接結果表明，MOL000522、MOL001495、MOL001494等83個化學成分與MAPK1、IL6、HSP90AA1等12個靶點蛋白的Total Score值≥5.0。Total Score值≥9.0的代表性核心活性成分與靶點蛋白分子對接模式(圖 6)。
1
NOD-like and Toll-like receptor signaling pathway各化學成分與靶點蛋白作用的Total Score值
Total score values of each chemical component interacting with target protein in NOD like and total like receptor signaling pathway
No.Medicinal materialsChemical compositionTarget proteinTotal ScoreMOL0017284.9750Isatidis radixMOL0017744.7116MOL0018038.7373MOL0048068.2133MOL0048086.5849MOL0048385.7862Glycyrrhizae radix et rhizomaMOL0048916.0748MOL0049054.27351MOL004959MAPK17.1327MOL0049885.8852MOL0049899.2094Glycyrrhizae radix et rhizoma、Armeniacae semen amarumMOL0049086.7727Pogostemonis herbaMOL0059115.7615MOL00052210.231Forsythiae fructusMOL0032835.6543MOL0033309.0596MOL0033705.8832Isatidis radixMOL0017742.77122Armeniacae semen amarumMOL002211IL67.2272Forsythiae fructusMOL0033655.8637MOL0005007.0339MOL0048069.0092MOL0048385.4535MOL0048498.8892MOL0048558.9802MOL0048566.7809MOL0048577.8582MOL0048639.4006MOL0048648.6671MOL0048838.3102MOL0048847.3729MOL0049045.8715Glycyrrhizae radix et rhizomaMOL0049051.7412MOL0049107.6057MOL0049117.15483MOL004935HSP90AA18.6197MOL0049457.7389MOL0049497.6895MOL0049597.5331MOL0049807.0161MOL0049886.5771MOL0049897.9668MOL0050018.1583MOL0050167.0515MOL0050085.7821Glycyrrhizae radix et rhizoma、Armeniacae semen amarumMOL0049089.5050MOL0023116.2047Pogostemonis herbaMOL0059166.7172Forsythiae fructusMOL0032836.3775MOL0033706.1435Ryopteridis crassirhizomatis rhizomaMOL0010406.2675Isatidis radixMOL0017908.6973MOL0048487.6923MOL004905-13.04914Glycyrrhizae radix et rhizomaMOL004935TNF8.3922MOL0049595.2719MOL0049898.7198MOL005013-12.0236Forsythiae fructusMOL0033655.59135Forsythiae fructusMOL000791CCL26.54406Glycyrrhizae radix et rhizoma 、Armeniacae semen amarumMOL002311NFKB13.3351Glycyrrhizae radix et rhizomaMOL0050003.8014MOL0028445.1758Glycyrrhizae radix et rhizomaMOL0050132.56807Lonicerae japonicae flosMOL003006 MOL003014CASP15.2431 5.6239Forsythiae fructusMOL0033303.3774Lonicerae japonicae flos、EphedraeMOL001494NLRP39.86838herba praeparata cum melleLonicerae japonicae flosMOL00149510.1359MOL0018036.2639Isatidis radixMOL0018146.6419Rhei radix et rhizomeMOL0022357.3826Glycyrrhizae radix et rhizoma、Pogostemonis herba、japonicae flos、Forsythiae fructus、Houttuyniae herba、Ephedrae herbaMOL0000986.0542praeparata cum melleMOL0002396.1381MOL0003547.2169MOL0005005.8799MOL0025653.9326MOL0028444.9174MOL0048106.4536MOL0048668.1841Glycyrrhizae radix et rhizomaMOL0048913.8563MOL0049047.64799MOL004905PIK3CG-4.5592MOL0049414.8181MOL0049616.2743MOL0049665.1168MOL0049746.9209MOL0049898.4427MOL0050076.3041Pogostemonis herbaMOL0059117.0538Lonicerae japonicae flosMOL0030957.6467Armeniacae semen amarumMOL0129226.5879MOL0001735.3401MOL0032907.2718Forsythiae fructusMOL0033087.3495MOL0033307.7492Ryopteridis crassirhizomatis rhizomaMOL0026050.8139MOL0028236.0577Ephedrae herba praeparata cum melleMOL0058425.6310Isatidis radixMOL0017355.9142Rhei radix et rhizomeMOL0022356.8423Glycyrrhizae radix et rhizoma、Pogostemonis herba、 japonicae flos、Forsythiae fructus、Houttuyniae herba、Ephedrae herbaMOL0000985.822310praeparata cum melleMOL000422AKT15.4487Glycyrrhizae radix et rhizoma、Lonicerae japonicae flos、Forsythiae fructus、ryopteridis crassirhizomatis rhizoma、Houttuyniae herba、Ephedrae herba praeparata cum melleMOL0002395.8410MOL0003546.6103MOL0048285.9371MOL0048638.0458Glycyrrhizae radix et rhizomaMOL0048667.7877MOL0048914.2970MOL0049044.6532MOL0049497.8296MOL0049616.2984Lonicerae japonicae flos、Forsythiae fructus、Ephedrae herba praeparata
cum melleMOL000006AKT16.0612MOL0014959.7707Lonicerae japonicae flosMOL0030446.1451MOL0031175.1368MOL0028235.2484Ephedrae herba praeparata cum melleMOL0028817.1609MOL0058426.395711Ryopteridis crassirhizomatis rhizomaMOL002605TLR44.885112Glycyrrhizae radix et rhizomaMOL004988TLR77.2271Isatidis radixMOL0017286.1353MOL00174910.2153Glycyrrhizae radix et rhizoma、Armeniacae semen amarumMOL0049084.3256MOL0003926.7941MOL0004177.4214MOL0028446.8041MOL0048158.943813MOL004833TLR95.7856Glycyrrhizae radix et rhizomaMOL0048798.0629MOL0048855.5260MOL0048915.4322MOL0049076.7363MOL0049578.3794MOL0049908.3002MOL0050167.7733
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代表性核心活性成分與靶點蛋白分子對接模式
Molecular docking mode of representative core active components and target proteins (Total Score ≥9.0).
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3. 討論
通過網絡藥理學研究連花清瘟膠囊與COVID-19的臨床表現(“fever ”“、coughing ”“、fatigue ”)關係結果可知，在涉及到的35條信號通路中，Benjamini correction最小的2個信號通路為NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway，Benjamini correction分別為5.8E-5、1.5E-6。NOD受體可識別進入細胞內的病原微生物及其產物，快速啟動信號傳遞，激活天然免疫效應機製; Toll受體可識別細胞外病原體，並將信號傳遞至細胞內激發機體天然免疫係統。二種模式識別受體可獨立進行自我辨識，同時又相互聯係協調，在啟動天然免疫反應中共同發揮重要作用，可激活免疫係統，破壞免疫耐受狀態，糾正自身免疫性疾病[6-7]。連花清瘟膠囊提高COVID-19的臨床治愈率可能主要與提高患者自身免疫能力、抑製炎症反應有關。為此，以NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway涉及的靶點蛋白及其化學成分進行了分子對接結果分析，驗證連花清瘟膠囊化學成分與靶點蛋白的作用。MOL000522、MOL001495、MOL001494等83個化學成分與MAPK1、IL6、HSP90AA1等12個靶點蛋白的Total Score值≥5.0，Total Score值≥9.0涉及到的主要靶點蛋白有MAPK1、NLRP3、HSP90AA1、TLR9、AKT1。
MAPK可調節細胞增殖、分化、死亡、應激反應和凋亡等關鍵細胞活動[8]，在細胞生命中起著重要作用[9]。MAPK1是多種生化信號的整合點，參與細胞增殖分化、轉錄調控和細胞的有絲分裂自噬等多種生物學過程，在治療各種炎症性疾病中發揮重要作用，也是急性肺損傷(ALI)炎症反應和LPS誘導的細胞損傷的重要調節因子[10-14]。由本文網絡藥理學和分子對接結果可知，來自連翹、甘草、板藍根、苦杏仁、廣藿香的14個化學成分與MAPK1靶點蛋白的分子對接結果Total Score值>5.0，其中MOL000522(連翹)、MOL004989(甘草)、MOL003330(連翹)與MAPK1靶點蛋白的分子對接結果Total Score值>9.0。連花清瘟膠囊作用於MAPK1靶點蛋白，可能通過細胞凋亡調控、細胞程序性死亡的調控等生物學途徑，提高患者自身免疫能力、抑製炎症反應發揮提高COVID-19臨床治愈率作用。
NLRP3炎症小體作為機體固有免疫及應激係統的重要防禦成分，不但可以識別細菌、病毒等病原體引發機體發生固有免疫應答，還負責炎症反應的激活[15-17]，參與了多種疾病發生和進展[18]，在先天免疫中起著重要作用[19]。近年來，愈來愈多的研究表明NLRP3炎性體在肺部感染性疾病中參與並發揮多種作用[20]。如在各種類型ALI中介導了炎症介質的生成和炎症細胞的浸潤，增加肺泡上皮細胞的通透性，促進肺水腫的形成[21]。抑製或缺失NLRP3可特異性減輕輻射和脂多糖治療引起的小鼠肺部炎症[22]。中藥成分也可通過抑製NLRP3炎症小體活化，繼而減輕脂多糖誘導的ALI[23-25]。由本文網絡藥理學和分子對接結果可知，MOL001494(金銀花、炙麻黃)、MOL001495(金銀花)與NLRP3靶點蛋白的分子對接結果Total Score值>9.0。連花清瘟膠囊作用於NLRP3靶點蛋白，可能通過細胞凋亡調控、細胞程序性死亡的調控等生物學途徑，提高機體固有免疫及應激功能，激活並參與炎症反應，在提高COVID-19臨床治愈率中發揮重要作用。
作為鳥流感病毒結合受體的細胞表麵蛋白HSP90AA1在感染早期通過HSP90AA1-AKT-MTOR途徑誘導自噬。一旦病毒識別，HSP90AA1和AKTMTOR通路的直接連接會觸發自噬，這是控製感染的關鍵步驟[26]。由本文網絡藥理學和分子對接結果可知，來自連翹、甘草、苦杏仁、廣藿香、綿馬貫眾的30個化學成分與HSP90AA1靶點蛋白的分子對接結果Total Score值>5.0，其中MOL004908(甘草、苦杏仁)、MOL004863、MOL004806(甘草)與HSP90AA1靶點蛋白的分子對接結果Total Score值>9.0。連花清瘟膠囊作用於HSP90AA1靶點蛋白，可能通過對有機物的反應、細胞生物合成過程的正調控等生物學途徑，觸發自噬控製病毒感染，在提高COVID-19臨床治愈率中發揮重要作用。
TLR9可激活固有免疫係統，參與傳染病檢測[27-28]。TLR9和磷脂酰肌醇-3-激酶γ(PI3Kγ)是免疫應答中非常重要的效應因子。免疫應答需要PI3Kγ，其中TLR9是相關的觸發因子[29-30]。在穩態條件下，不適當的TLR9反應可導致嚴重的自體炎症性疾病，阻斷TLR9炎症通路被激活，控製疾病進展和炎症並發症[31]。在肺缺血再灌注過程中釋放的線粒體DNA(mtDNA)會觸發TLR9依賴性網絡的形成，並導致肺損傷[32]。由本文網絡藥理學和分子對接結果可知，來自板藍根、甘草、苦杏仁的14個化學成分與TLR9靶點蛋白的分子對接結果Total Score值>5.0，其中MOL001749(板藍根)與TLR9靶點蛋白的分子對接結果Total Score值>9.0。連花清瘟膠囊作用於TLR9靶點蛋白，可能通過對傷害的反應、細胞因子產生的調節、細胞生物合成過程的正調控等生物學途徑，激活固有免疫係統，在預防疾病進展和炎症並發症的發展中起到作用[31]，提高COVID-19臨床治愈率。
AKT1是調節細胞存活的信號通路中的一個中心節點。AKT1調控的多種途徑在細胞內通過100多種細胞底物的磷酸化進行溝通[33]。如肺纖維化和高碳酸血症。特發性肺纖維化是一種進行性間質性肺炎，以成纖維細胞聚集、膠原沉積和細胞外基質重塑為特征。AKT1通過誘導巨噬細胞產生IL-13來調節肺纖維化，表明靶向AKT1可能同時阻斷特發性肺纖維化的纖維化過程[34]。高碳酸血症是嚴重急性和慢性肺部疾病患者死亡的危險因素。靶向AKT1或升高CO2信號的下遊通路可以增強巨噬細胞抗病毒宿主的防禦能力，並改善晚期肺部疾病高碳酸血症患者的臨床預後[35]。由本文網絡藥理學和分子對接結果可知，來自甘草、金銀花、連翹、綿馬貫眾、魚腥草、炙麻黃、廣藿香、金銀花、板藍根、大黃的18個化學成分與AKT1靶點蛋白的分子對接結果Total Score值>5.0，其中MOL001495(金銀花)與AKT1靶點蛋白的分子對接結果Total Score值>9.0。連花清瘟膠囊作用於AKT1靶點蛋白，可能通過細胞凋亡調控、細胞程序性死亡的調控、細胞死亡調控、多細胞生物過程的正調控等生物學途徑，在提高COVID-19臨床治愈率中發揮重要作用。
COVID-19屬中醫肺絡病，其臨床病理特征是免疫係統功能障礙和炎症反應引起的深氣道、肺泡的損害，還可見重度肺充血。連花清溫膠囊以絡病理論為指導，對許多病毒如sars-CoV、mers-CoV和炎症反應有抑製作用，已納入國家的COVID-19診斷和治療計劃，其理論組方特色和臨床基礎研究已得到廣泛認可，是治療呼吸係統疾病的代表性藥物[36]。最新研究表明[36]，連花清瘟膠囊可抑製體外培養的COVID-19活性，顯著緩解COVID-19患者的發熱、咳嗽、乏力等症狀，為連花清瘟膠囊治療COVID-19提供了理論和臨床依據。
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Biography
鄢海燕，教授，E-mail: moc.621@1080yhy
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Funding Statement
2018年度安徽省省級質量工程項目(2018jyxm1273)
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References
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